Montag, 19. April 2021

Reverse-transkribierte SARS-CoV-2-RNA kann sich in das Genom kultivierter menschlicher Zellen integrieren und in patientenabgeleitetem Gewebe exprimiert werden

Beigetragen von Rudolf Jaenisch, 19. April 2021 (verabgerufen zur Überprüfung am 29. März 2021; überprüft von Anton Berns und Anna Marie Skalka)

Bedeutung

Ein ungelöstes Problem der SARS-CoV-2-Krankheit ist, dass Patienten oft positiv auf virale RNA bleiben, wie sie viele Wochen nach der ersten Infektion durch PCR nachgewiesen wurde, da keine Beweise für die Virusreplikation vorliegen. Wir zeigen hier, dass SARS-CoV-2-RNA umgekehrt transkribiert und in das Genom der infizierten Zelle integriert und als chimäre Transkripte exprimiert werden kann, die virale mit zellulären Sequenzen verschmelzen. Wichtig ist, dass solche chimären Transkripte in vom Patienten gewonnenen Gewebe nachgewiesen werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass in einigen Patientengeweben die Mehrheit aller viralen Transkripte aus integrierten Sequenzen abgeleitet wird. Unsere Daten geben einen Einblick in die Folgen von SARS-CoV-2-Infektionen, die erklären können, warum Patienten nach der Genesung weiterhin virale RNA produzieren können.

Abstrakt

Längerer Nachweis der schweren akuten respiratorischen Syndrom-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA und das Wiederauftreten von PCR-positiven Tests wurden bei Patienten nach Genesung von COVID-19 weithin berichtet, aber einige dieser Patienten scheinen kein Infektionsvirus auszuscheiden. Wir untersuchten die Möglichkeit, dass SARS-CoV-2-RNAs umgekehrt transkribiert und in die DNA menschlicher Zellen in Kultur integriert werden können und dass die Transkription der integrierten Sequenzen einige der positiven PCR-Tests bei Patienten erklären könnte. Zur Unterstützung dieser Hypothese fanden wir heraus, dass DNA-Kopien von SARS-CoV-2-Sequenzen in das Genom infizierter menschlicher Zellen integriert werden können. Wir fanden Duplikationen an der Zielstelle, die die Virussequenzen flankierten, und Konsens-LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenzen an den Integrationsstandorten, die mit einem LINE1-Retrotransposon-vermittelten, zielprimierten Reverse-Transkriptions- und Retropositionsmechanismus übereinstimmen. Wir fanden auch in einigen von Patienten gewonnenen Geweben Hinweise darauf, dass ein großer Teil der Virussequenzen aus integrierten DNA-Kopien von Virussequenzen transkribiert wird, wodurch chimäre Transkripte vom Virus-Wirt erzeugt werden. Die Integration und Transkription von Virussequenzen kann somit zum Nachweis viraler RNA durch PCR bei Patienten nach einer Infektion und klinischer Genesung beitragen. Da wir nur subgenomische Sequenzen nachgewiesen haben, die hauptsächlich vom 3′-Ende des in die DNA der Wirtszelle integrierten viralen Genoms abgeleitet wurden, kann das infektiöse Virus nicht aus den integrierten subgenomischen SARS-CoV-2-Sequenzen hergestellt werden.

Kontinuierliche oder wiederkehrende positive PCR-Tests des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) wurden in Proben berichtet, die Wochen oder Monate nach der Genesung von einer Erstinfektion (1-17) von Patienten entnommen wurden. Obwohl kürzlich eine echte Reinfektion mit SARS-CoV-2 nach der Genesung berichtet wurde (18), deuteten kohortenbasierte Studien mit Probanden, die nach der Genesung von COVID-19 in strenger Quarantäne gehalten wurden, darauf hin, dass zumindest einige "repositive" Fälle nicht durch eine Reinfektion verursacht wurden (19, 20). Darüber hinaus wurde von diesen PCR-positiven Patienten (1–3, 5, 6, 12, 16) kein replikationskompetentes Virus isoliert oder verbreitet, und die Ursache für die verlängerte und wiederkehrende Produktion viraler RNA bleibt unbekannt. SARS-CoV-2 ist ein positiv gestrandetes RNA-Virus. Wie andere Beta-Coronaviren (SARS-CoV-1 und Coronavirus mit dem Nahost-Atemwegssyndrom) verwendet SARS-CoV-2 eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, um seine genomische RNA zu replizieren und subgenomische RNAs zu transkribieren (21-24). Eine mögliche Erklärung für den fortgesetzten Nachweis von SARS-CoV-2-Virus-RNA ohne Virusvermehrung ist, dass sich in einigen Fällen DNA-Kopien viraler subgenomischer RNAs durch einen umgekehrten Transkriptionsmechanismus in die DNA der Wirtszelle integrieren können. Die Transkription der integrierten DNA-Kopien könnte für positive PCR-Tests lange nach der Entnahme der Erstinfektion verantwortlich sein. Tatsächlich wurden nicht-retrovirale RNA-Virussequenzen in den Genomen vieler Wirbeltierarten (25, 26) nachgewiesen, wobei mehrere Integrationen Signale aufweisen, die mit der Integration von DNA-Kopien viraler mRNAs in die Keimbahn über alte lange durchsetzte Kernelement-Retrotransposons (LINE) übereinstimmen (überprüft in Ref. 27). Darüber hinaus können nicht-retrovirale RNA-Viren wie das vesikuläre Stomatitis-Virus oder das lymphatische Choriomeningitis-Virus (LCMV) durch eine endogene Reverse-Transkriptase (RT) in DNA-Kopien transkribiert werden, und es wurde gezeigt, dass sich DNA-Kopien der Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zelluläre RNAs, zum Beispiel die menschlichen APP-Transkripte, durch endogene RT in Neuronen mit den resultierenden APP-Fragmenten, die in das Genom integriert und exprimiert wurden (31) zurücktranskribiert werden. Menschliche LINE1-Elemente (∼17% des menschlichen Genoms), eine Art autonomer Retrotransposons, die in der Lage sind, sich selbst und andere nichtautonome Elemente wie Alu retrotransponieren zu können, sind eine Quelle zellulärer endogener RT (32-34). Es wurde gezeigt, dass endogene LINE1-Elemente in gealtertem menschlichem Gewebe exprimiert werden (35) und eine LINE1-vermittelte somatische Retrotransposition bei Krebspatienten häufig ist (36, 37). Darüber hinaus wird die Expression von endogenen LINE1 und anderen Retrotransposonen in Wirtszellen häufig bei Virusinfektionen, einschließlich SARS-CoV-2-Infektionen (38-40), hochreguliert.

In dieser Studie zeigen wir, dass SARS-CoV-2-Sequenzen durch einen LINE1-vermittelten Retropositionsmechanismus in das Genom der Wirtszelle integriert werden können. Wir liefern Beweise dafür, dass die integrierten Virussequenzen transkribiert werden können und dass in einigen Patientenproben die Mehrheit der viralen Transkripte aus integrierten Virussequenzen abgeleitet zu sein scheint.

Ergebnisse

Integration von SARS-CoV-2-Sequenzen in die DNA von Wirtszellen in der Kultur.

Wir haben drei verschiedene Ansätze verwendet, um genomische SARS-CoV-2-Sequenzen zu erkennen, die in das Genom infizierter Zellen integriert sind. Diese Ansätze waren Nanoporen-Langlesesequenzierung, Illumina-Paar-End-Ganzgenomiksequenzierung und Tn5-Tagmentierungsbasierte DNA-Integrationsort-Anreicherungssequenzierung. Alle drei Methoden lieferten Beweise dafür, dass SARS-CoV-2-Sequenzen in das Genom der Wirtszelle integriert werden können.

Um die Wahrscheinlichkeit des Nachweises seltener Integrationsereignisse zu erhöhen, transfizierten wir HEK293T-Zellen mit LINE1-Expressionsplasmiden vor der Infektion mit SARS-CoV-2 und isolierter DNA aus den Zellen 2 d nach der Infektion (SI-Anhang, Abb. S1A). Wir haben DNA-Kopien von SARS-CoV-2-Nukleokanisidsequenzen (NC) in den infizierten Zellen durch PCR nachgewiesen (SI-Anhang, Abb. S1B) und klonte das komplette NC-Gen (SI-Anhang, Abb. S1D) aus großfragmentiger genomischer DNA, die gelgereinigt worden war (SI-Anhang, Abb. S1C). Die virale DNA-Sequenz (NC) wurde durch Sanger-Sequenzierung (Datensatz S1) bestätigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SARS-CoV-2-RNA umgekehrt transkribiert werden kann und die resultierende DNA in das Genom der Wirtszelle integriert werden könnte.

Um direkt zu zeigen, dass die SARS-CoV-2-Sequenzen in das Genom der Wirtszelle integriert wurden, wurde DNA, die aus infizierten LINE1-überexprimierenden HEK293T-Zellen isoliert wurde, für die Nanoporen-Langlesesequenzierung verwendet (Abb. 1A). Abb. 1 B-D zeigt ein Beispiel für eine virale NC subgenomische RNA-Sequenz (1.662 bp), die in das Zellchromosom X integriert und auf beiden Seiten von Wirts-DNA-Sequenzen flankiert wird. Wichtig ist, dass die flankierenden Sequenzen eine direkte Wiederholung von 20 PS enthielten. Diese Zielsite-Duplizierung ist eine Signatur der LINE1-vermittelten Retro-Integration (41, 42). Ein weiterer viraler Integrant, der eine partielle subgenomische NC-RNA-Sequenz umfasst, die von einer duplizierten Wirtszell-DNA-Zielsequenz flankiert wurde, ist im SI-Anhang, Abb. S2 A-C. In beiden Fällen enthielten die flankierenden Sequenzen eine Konsenserkennungssequenz der LINE1-Endonuklease (43). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SARS-CoV-2-Sequenzen durch einen LINE1-vermittelten Retropositionsmechanismus in die Genome kultivierter menschlicher Zellen integriert werden können. Tabelle 1 fasst alle verknüpften SARS-CoV-2-Wirtssequenzen zusammen, die wiederhergestellt wurden. DNA-Kopien von Teilen des viralen Genoms wurden in fast allen menschlichen Chromosomen gefunden. Zusätzlich zu den beiden Beispielen in Abb. 1 und SI-Anhang, Abb. S2 haben wir auch zelluläre Sequenzen für 61 Integranten wiederhergestellt, für die nur einer der beiden Wirt-Virus-Übergänge abgerufen wurde (SI-Anhang, Abb. S2 D-F und Tabelle 1; Nanoporen lesen, die die in Datensatz S2 zusammengefassten chimären Sequenzen enthalten. Wichtig ist, dass etwa 67% der flankierenden menschlichen Sequenzen entweder einen Konsens oder eine variante LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenz (wie TTTT/A) enthielten (SI-Anhang, Abb. S2 D-F und Tabelle 1). Diese LINE1-Erkennungssequenzen befanden sich entweder an den chimären Kreuzungen, die direkt mit dem 3′-Ende (Poly-A-Schwanz) der Virussequenzen verbunden waren, oder innerhalb einer Entfernung von 8–27 bp von den Kreuzungen, die mit dem 5′-Ende der Virussequenzen verbunden waren, das sich innerhalb der potenziellen Du Beide Ergebnisse stimmen mit einem Modell überein, bei dem die LINE1-vermittelte Retroposition einen Mechanismus zur Integration von DNA-Kopien von SARS-CoV-2-subgenomfragmenten in die genomische DNA des Wirts bietet. Etwa 71% der Virussequenzen wurden von intron- oder intergenen Zellsequenzen und 29% von Exonen flankiert (Abb. 1F und Tabelle 1). Daher ist die Assoziation der Virussequenzen mit Exonen viel höher als für die zufällige Integration in das Genom [menschliches Genom: 1,1% Exons, 24% Introns und 75% intergene DNA (44)], was auf eine bevorzugte Integration in exon-assoziierte Zielstellen hindeutet. Während frühere Studien keine Präferenz für die LINE1-Retroposition in Exons zeigten (45, 46), deutet unser Ergebnis darauf hin, dass die LINE1-vermittelte Retroposition einiger anderer RNAs unterschiedlich sein kann. Wir stellten fest, dass viral-zelluläre Grenzen häufig in der Nähe der 5′ oder 3′ unübersetzten Regionen (UTRs) der zellulären Gene lagen, was darauf hindeutet, dass es eine Präferenz für die Integration in der Nähe von Promotoren oder Poly(A)-Standorten in unserem Versuchssystem gibt.

Abb. 1.

SARS-CoV-2-RNA kann umgekehrt transkribiert und in das Genom der Wirtszelle integriert werden. (A) Experimenteller Workflow. (B) Chimäre Sequenz aus einer Nanoporen-Sequenzierung, die die Integration einer SARS-CoV-2 NC-subgenomischen RNA-Sequenz (magenta) und menschlicher genomischer Sequenzen (blau) zeigt, die beide Seiten der integrierten Virussequenz flankieren. Zu den Merkmalen, die auf LINE1-vermittelte "zielgrundierte Reverse-Transkription" hinweisen, gehören die Duplizierung der Zielseite (gelbes Highlight) und die LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenz (unterstrichen). Sequenzen, die beiden Genomen zugeordnet werden könnten, werden in Lila mit Diskrepanzen zu den menschlichen genomischen Sequenzen in Kursivschrift angezeigt. Die Pfeile zeigen die Sequenzorientierung in Bezug auf die menschlichen und SARS-CoV-2-Genome an, wie in C und D gezeigt. (C) Ausrichtung der Nanopore, die in B gelesen wird, mit dem menschlichen Genom (Chromosom X), das die Integrationsstelle zeigt. Die menschlichen Sequenzen an der Kreuzungsregion zeigen die Zielstelle, die dupliziert wurde, als die SARS-CoV-2 cDNA integriert wurde (gelbes Highlight) und die LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenz (unterstrichen). (D) Die Ausrichtung der Nanopore, die in B gelesen wird, mit dem SARS-CoV-2-Genom, das zeigt, dass die integrierte virale DNA eine Kopie der subgenomischen NC-RNA in voller Länge ist. Die hellblau hervorgehobenen Bereiche werden vergrößert, um TRS-L (I) und TRS-B (II)-Sequenzen zu zeigen (unterstrichen, dies sind die Sequenzen, in denen die virale Polymerase springt, um die subgenomische RNA zu erzeugen) und das Ende der Virussequenz am Poly(A)-Schwanz (III Diese viralen Sequenzmerkmale (I-III) zeigen, dass eine DNA-Kopie der subgenomischen NC-RNA in voller Länge retrointegriert war. (E) Ein human-virales chimäres Lesepaar aus der Illumina-Paarend-Ganzgenomsequenzierung. Das Lesepaar wird mit Ausrichtung auf die menschlichen (blauen) und SARS-CoV-2- (magenta) Genome gezeigt. Die Pfeile zeigen die Leseorientierungen in Bezug auf die menschlichen und SARS-CoV-2-Genome an. Der hervorgehobene (hellblaue) Bereich der menschlichen Lesezuordnung wird vergrößert, um die LINE1-Erkennungssequenz (unterstrichen) anzuzeigen. (F) Verteilungen von human-CoV2-Chimären Verbindungen aus der Nanoporen- (links) und Illumina-Sequenzierung (rechts) in Bezug auf Merkmale des menschlichen Genoms.

Tabelle 1.

Zusammenfassung der human-CoV2-Chimären Sequenzen, die durch Nanoporen-DNA-Sequenzierung infizierter LINE1-überexprimierender HEK293T-Zellen erhalten wurden

	Anzahl der Sequenzen mit Mensch-CoV2-Übergang	Mit LINE1-Erkennungssequenz an/in der Nähe der Kreuzung (z. B. TTTT/A)	Kreuzung am menschlichen Intergen	Kreuzung am menschlichen Intron	Kreuzung am menschlichen Exon/UTR
chr1	10	6	0	6	4
chr2	2	2	0	2	0
chr3	3	3	0	3	0
chr4	2	2	0	1	1
chr5	1	1	0	1	0
chr6	4	2	3	0	1
chr7	2	2	1	1	0
chr8	0	0	0	0	0
chr9	4	2	0	2	2
chr10	5	1	2	1	2
chr11	3	2	1	1	1
chr12	6	4	2	2	2
chr13	3	3	3	0	0
chr14	2	2	1	1	0
chr15	0	0	0	0	0
chr16	2	1	1	1	0
chr17	2	0	1	0	1
chr18	2	1	0	2	0
chr19	1	1	0	0	1
chr20	0	0	0	0	0
chr21	2	1	1	1	0
chr22	1	1	0	1	0
chrX	6	5	2	1	3
Insgesamt	63	42	18	27	18
Bruchteil		66,7%	28,6%	42,9%	28,6%

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Um die Integration von SARS-CoV-2-Sequenzen in die genomische DNA durch eine andere Methode zu bestätigen, haben wir DNA, die aus LINE1-transfizierten und SARS-CoV-2-infizierten HEK293T-Zellen isoliert wurde, Illumina-Paar-End-Ganzgenomsequenzierung unterzogen, wobei eine Tn5-basierte Bibliothekskonstruktionsmethode (Illumina Nextera) verwendet wurde, um Ligaturartefakte zu vermeiden. Virale DNA-Lesungen konzentrierten sich am 3′-Ende des SARS-CoV-2-Genoms (SI-Anhang, Abb. S3). Wir haben 17 virale Integranten (Summe von zwei Replikaten) wiedergefunden, indem wir human-virale chimäre DNA-Sequenzen kartiert haben (Abb. 1E und Tabelle 2, chimäre Sequenzen, zusammengefasst in Datensatz S3); 7 (41%) der Kreuzungen enthielten entweder einen Konsens oder eine variante LINE1-Erkennungssequenz in den zellulären Sequenzen in der Nähe der Kreuzung (Abb. 1E undTabelle 2), im Einklang mit einem LINE1-vermittelten Retropositionsmechanismus. Ähnlich wie die Ergebnisse der Nanoporensequenzierung wurden etwa 76% der Virussequenzen von intron- oder intergenen Zellsequenzen und 24% von Exonen flankiert (Abb. 1F und Tabelle 2).

Tabelle 2.

Zusammenfassung der human-CoV2-Chimären Sequenzen, die durch die Illumina-Paar-End-Gesamtgenom-DNA-Sequenzierung infizierter LINE1-überexprimierender HEK293T-Zellen erhalten wurden

Merkmale der Region (menschlich)	Intergen	Intron	Exon/UTR
Regionalnummer	4	9	4
Mit L1-Erkennungssequenz an/in der Nähe der Kreuzung	2	3	2

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Etwa 32% der SARS-CoV-2-Sequenzen (6/21 Integrationsereignisse in Nanoporen, 4/10 in Illumina-Daten) wurden in LINEs, kurz durchsetzten Kernelementen oder langen terminalen Wiederholungselementen ohne Beweise für eine LINE1-Erkennungsstelle integriert, was darauf hindeutet, dass es einen alternativen Reverse-Transkriptions-/

Um zu beurteilen, ob eine genomische Integration von SARS-CoV-2-Sequenzen auch in infizierten Zellen auftreten könnte, die RT nicht überexprimierten, isolierten wir DNA aus virusinfizierten HEK293T- und Calu3-Zellen, die nicht mit einem RT-Expressionsplasmid transfiziert wurden (Abb. 2A). Tn5 Tagmentation-vermittelte DNA-Integrationsstandort-Anreicherungssequenzierung (47, 48) (Abb. 2B und SI Anhang, Abb. S4A) entdeckte insgesamt sieben SARS-CoV-2-Sequenzen, die mit zellulären Sequenzen in diesen Zellen verschmolzen waren (Summe von drei unabhängigen Infektionen von zwei Zelllinien), die alle LINE1-Erkennungssequenzen in der Nähe der Human-SARS-CoV-2-Sequenzübergänge zeigten (Abb. 2 C-F und SI Anhang, Abb. S4 B-D, chimäre Sequenzen zusammengefasst in Datensatz S4).

Abb. 2.

Beweise für die Integration von SARS-CoV-2 cDNA in kultivierte Zellen, die eine umgekehrte Transkriptase nicht überexprimieren. (A) Experimenteller Workflow. (B) Experimentelles Design für die Tn5-Tagmentation-vermittelte Anreicherungssequenzierungsmethode, die zur Kartierung von Integrationsstandorten im Wirtszellgenom verwendet wird. (C) Ein human-virales chimäres Lesepaar, das die virale Integration unterstützt. Die Lesevorgänge sind auf die genomischen Sequenzen des Menschen (blau) und SARS-CoV-2 (magenta) ausgerichtet. Die Pfeile zeigen die Leseorientierungen in Bezug auf die menschlichen und SARS-CoV-2-Genome an, wie in D und E gezeigt. Die Reihenfolge des viralen Primers, der für die Anreicherung verwendet wird, wird mit grünem Highlight in der Lesung angezeigt (entspricht dem grünen Pfeil, der in B dargestellt ist). Sequenzen, die beiden Genomen zugeordnet werden könnten, werden violett dargestellt. (D) Ausrichtung des Lesepaares in C am menschlichen Genom (Chromosom 15, blauer Pfeil). Der hervorgehobene (hellblaue) Bereich der menschlichen Sequenz wird vergrößert, um die LINE1-Erkennungssequenz (unterstrichen) mit einer 19-Basen-Poly-dT-Sequenz (lila Highlight) anzuzeigen, die vom viralen Poly-A-Schwanz für die "zielvoreinigte umgekehrte Transkription" geglüht werden könnte. Zusätzliche 5-bp-Humansequenz (GAATG, blau) wurde in Read 2 (C) erfasst und unterstützt eine echte Integrationsseite. (E) Ausrichtung des Lesepaares in C mit dem SARS-CoV-2-Genom (magenta). Die virale Primer-Sequenz wird mit grünem Highlight angezeigt. (F) Zusammenfassung von sieben human-viralen chimären Sequenzen, die durch die Anreicherungssequenzierungsmethode in den beiden Zelllinien identifiziert wurden, die die integrierten menschlichen Chromosomen, LINE1-Erkennungssequenzen in der Nähe des chimären Übergangs und menschliche genomische Merkmale an der Leseübergang zeigen.

Expression von viral-zellulären chimären Transkripten in infizierten kultivierten Zellen und vom Patienten stammenden Geweben.

Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass in das Genom integrierte SARS-CoV-2-Sequenzen exprimiert werden können, analysierten wir veröffentlichte RNA-Seq-Daten von SARS-CoV-2-infizierten Zellen auf Hinweise auf chimäre Transkripte (49). Prüfung dieser Datensätze (50-55) (SI-Anhang, Abb. S5) ergab eine Reihe von human-viralen chimären Lesevorgängen (SI-Anhang, Abb. S6 A und B). Diese traten bei mehreren Probentypen auf, einschließlich kultivierter Zellen und Organoide aus Lungen-/Herz-/Gehirn-/Magengewebe (SI-Anhang, Abb. S6B). Die Häufigkeit der chimären Lesevorgänge korrelierte positiv mit dem viralen RNA-Spiegel über die Probentypen hinweg (SI-Anhang, Abb. S6B). Chimäre Messvorgänge machten im Allgemeinen 0,004 bis 0,14% der gesamten SARS-CoV-2-Werte in den Proben aus. Die Mehrheit der chimären Verbindungen, die der Sequenz des SARS-CoV-2-NC-Gens zugeordnet sind (SI-Anhang, Abb. S6 C und D). Dies steht im Einklang mit der Feststellung, dass NC-RNA die am häufigsten vorkommende subgenomische SARS-CoV-2-RNA (56) ist, was sie zum wahrscheinlichsten Ziel für die umgekehrte Transkription und Integration macht. Jüngste Daten zeigten jedoch, dass bis zu 1% der RNA-Seq-Lesevorgänge aus SARS-CoV-2-infizierten Zellen aufgrund des RT-Umschaltens zwischen RNA-Vorlagen, die während des cDNA-Syntheseschritts bei der Vorbereitung einer RNA-Seq-Bibliothek (57) erfolgen kann, artefaktisch chim Da es also eine Mischung aus Wirts-mRNAs und viralen positiven strangigen mRNAs in infizierten Zellen gibt, wird die Identifizierung echter chimärer viralzellulärer RNA-Transkripte durch die Erzeugung von Artefaktchimmern in den Tests beeinträchtigt.

Wir argumentierten, dass die Orientierung einer integrierten DNA-Kopie von SARS-CoV-2-RNA in Bezug auf die Orientierung des Zielwirtsgens zufällig sein sollte, was vorhersagt, dass etwa die Hälfte der viralen DNAs, die in ein exprimiertes Wirtsgen integriert wurden, in einer Orientierung sein sollte, die der Richtung der Transkription des Wirtszellgens entgegengesetzt ist (Abb. 3A). Wie vorhergesagt, befanden sich ∼50% der viralen Integranten in menschlichen Genen in der entgegengesetzten Ausrichtung im Vergleich zum Wirtsgen in unserem Nanoporen-Datensatz (Integration in menschliche Gene mit LINE1-Erkennungssequenzen, Abb. 3B). Daher würden wir für chimäre Transkripte, die aus integrierten Virussequenzen abgeleitet werden, erwarten, dass ∼50% der chimären Transkripte negative virale Sequenzen enthalten sollten, die mit positiven Wirts-RNA-Sequenzen verknüpft sind. Wir haben daher den Anteil der viralen und human-viralen chimären Transkripte in infizierten kultivierten Zellen/Organoiden und in vom Patienten gewonnenen Geweben bestimmt, die negative virale RNA-Sequenzen enthalten.

Abb. 3.

Negative virale RNA-Seq-Lesungen deuten darauf hin, dass integrierte SARS-CoV-2-Sequenzen exprimiert werden. (A) Schema zur Vorhersage von Fraktionen von SARS-CoV-2-RNA-Seq-Lesevorgängen mit positivem oder negativem Strang, die von viralen (sub)genomischen RNAs oder aus Transkripten integrierter Virussequenzen abgeleitet sind. Die Pfeile (rechts), die die Ausrichtung eines integrierten SARS-CoV-2-positiven Strangs (magenta) relativ zur Ausrichtung des Wirtszellgens (blau) zeigen. (B) Fraktionen von SARS-CoV-2-Sequenzen, die in menschliche Gene mit der gleichen (n = 15) oder entgegengesetzten (n = 13) Ausrichtung des viralen positiven Strangs relativ zum positiven Strang des menschlichen Gens integriert sind. Insgesamt 28 Integrationsereignisse an menschlichen Genen mit LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenzen wurden aus unserer Nanoporen-DNA-Sequenzierung infizierter LINE1-überexprimierender HEK293T-Zellen identifiziert (Abb. 1A). (C) Bruchteil der gesamten viralen Ablesewerte, die aus negativer viraler RNA in akut infizierten Zellen oder Organoiden abgeleitet werden (siehe SI-Anhang, Tabelle S1 für Details). (D) Anteil der human-viralen chimären Lesewerte, die virale Sequenzen enthalten, die aus negativer viraler RNA in akut infizierten Zellen oder Organoiden abgeleitet sind (siehe SI-Anhang, Tabelle S1 für Details). (E) Bruchteil der gesamten viralen Lesevorgänge, die aus negativer viraler RNA in veröffentlichten RNA-Seq-Daten von Patienten abgeleitet werden (Autopsie-FFPE-Proben, GSE150316, Proben ohne virale Lesevorgänge oder von geringer Bibliotheksstrandqualität nicht enthalten; siehe SI-Anhang, Tabelle S2 für Details; (F) Anteil der human-viralen chimären Lesevorgänge, die virale Sequenzen enthalten, die aus negativer viraler RNA abgeleitet sind, in veröffentlichten RNA-Seq-Daten von Patienten (Autopsie-FFPE-Proben, GSE150316; siehe SI-Anhang, Tabelle S2 für Details). (G) Bruchteil der gesamten viralen Lesevorgänge, die aus viraler RNA mit negativem Strang in veröffentlichten RNA-Seq-Daten von Patienten abgeleitet werden (BALF-Proben, GSE145926; siehe SI-Anhang, Tabelle S3 für Details). Die roten gestrichelten Linien in E-G zeigen das Niveau an, bei dem 50% aller viralen Lesevorgänge (E und G) oder Virussequenzen in human-viralen chimären Lesevorgängen (F) aus viralen RNAs mit negativem Strang stammten, ein Gehalt, der erwartet wird, wenn alle Virussequenzen aus integrierten Sequenzen abgeleitet wurden.

Die Replikation von SARS-CoV2-RNA erfordert die Synthese von Virus-RNA mit negativem Strang, die als Vorlage für die Replikation viraler genomischer RNA und die Transkription viraler subgenomischer Positivstrang-RNA dient (21). Um die Prävalenz von viraler RNA mit negativem Strang in akut infizierten Zellen zu bewerten, ermittelten wir das Verhältnis von insgesamt positiven zu negativen RNAs. Zwischen 0 und 0,1% der gesamten viralen Ablesungen wurden aus Negativstrang-RNA in akut infizierten Calu3-Zellen oder Lungenorganoiden abgeleitet [unsere Daten und veröffentlichten Daten (50, 58)] (Abb. 3C- und SI-Anhang, Tabelle S1), ähnlich dem, was in klinischen Proben berichtet wurde, die früh nach der Infektion entnommen wurden (59). Diese Ergebnisse argumentieren, dass der Gehalt an viraler RNA mit negativem Strang mindestens 1.000-mal niedriger ist als der von viraler RNA mit positivem Strang in akut infizierten Zellen, zumindest teilweise aufgrund einer massiven Produktion von subgenomischer RNA mit positivem Strang während der Virusreplikation. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit erheblich, dass ein zufälliger Vorlagenwechsel während des umgekehrten Transkriptionsschritts in der RNA-Seq-Bibliothekskonstruktion einen großen Teil der Artefakt-Chimären Lesevorgänge erzeugen würde, die virale negative strand-RNA enthalten würden, die mit zellulären positiven strand-RNA-Sequenzen verschmolzen sind. Wir stellten fest, dass zwischen 0 und 1% der human-viralen chimären Lesevorgänge negative Strang-Virussequenzen in den akut infizierten Zellen/Organoiden enthielten (Abb. 3D- und SI-Anhang, Tabelle S1), im Einklang mit einem kleinen Bruchteil der viralen Lesevorgänge, die aus integrierten SARS-CoV-2-Sequenzen abgeleitet werden.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit akut infizierten Calu3-Zellen oder Lungenorganoiden erzielt wurden, wurden bis zu 51% aller viralen Lesevorgänge und bis zu 42,5% der human-viralen chimären Lesevorgänge aus der negativ abgestrangigen SARS-CoV-2-RNA in einigen von Patienten gewonnenen Geweben abgeleitet [veröffentlichte Daten (60 3 E-G und SI Anhang, Tabellen S2 und S3). Einzelzellanalyse von Patienten Lungenbronchoalveolarspülungsflüssigkeitszellen (BALF) von Patienten mit schwerem COVID [veröffentlichte Daten (61)] zeigte, dass bis zu 40% aller viralen Messwerte aus der negativen SARS-CoV-2-RNA stammen (SI-Anhang, Abb. S7). Fraktionen der Negativstrang-RNA in Geweben einiger Patienten waren Größenordnungen höher als die in akut infizierten Zellen oder Organoiden (Abb. 3 C-G). In festen (formalinfixierten, paraffinembedded [FFPE]) Autopsieproben bei 4 von 14 Patienten (Abb. 3E- und SI-Anhang, Tabelle S2) und in BALF-Proben bei 4 von 6 Patienten (Abb. 3G- und SI-Anhang, Tabelle S3), mindestens ∼20% der viralen Lesevorgänge wurden von viraler RNA mit negativem Strang abgeleitet. Im Gegensatz zu akut infizierten Zellen (Abb. 3 C und D und SI Anhang, Tabelle S1), es gab wenig oder keine Hinweise auf eine Virusreproduktion in diesen Autopsieproben (60). Wie in SI-Anhang, Tabelle S2, zusammengefasst, gab es negative Virussequenzen in einem großen Bruchteil der human-viralen chimären Lesevorgänge (bis zu ∼40%) in Proben eines Patienten. Verschiedene Proben, die vom selben Patienten stammen, zeigten einen ähnlich hohen Anteil an negativen viralen Strang-menschlichen RNA-Lesevorgängen. Mehrere andere Patientenproben zeigten einen geringeren Anteil an negativer viraler Strang-RNA-menschlicher RNA-Chimären, die jedoch immer noch signifikant höher waren als in akut infizierten Zellen (Abb. 3 D und F und SI Anhang, Tabelle S1 und S2). Da die Fähigkeit, viral-menschlich-chimäre Lesevorgänge mit kurzgelesenem RNA-Seq zu identifizieren, begrenzt ist, konnte unsere Analyse keine signifikante Anzahl von chimären Messwerten in BALF-Proben von Patienten zeigen (SI-Anhang, Tabelle S3). Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass in einigen von Patienten gewonnenen Geweben, in denen die Gesamtzahl der SARS-CoV-2-sequenzpositiven Zellen klein sein kann, ein großer Teil der viralen Transkripte aus SARS-CoV-2-Sequenzen hätte transkribiert werden können, die in das Wirtsgenom integriert sind.

Diskussion

Wir präsentieren hier Beweise dafür, dass SARS-CoV-2-Sequenzen umgekehrt transkribiert und in die DNA infizierter menschlicher Zellen in der Kultur integriert werden können. Für zwei der Integranten haben wir "human-viral-human" chimäre Lesevorgänge wiederhergestellt, die eine direkte Wiederholung der Zielstelle (20 oder 13 bp) umfassten, und an beiden Enden der Wirts-DNA, die die Virussequenzen flankierte, war eine Konsenserkennungsstelle der LINE1-Endonuklease vorhanden. Diese und andere Daten stimmen mit einem zielgrundierten Reverse-Transkriptions- und Retropositionsintegrationsmechanismus (41, 42) überein und deuten darauf hin, dass endogene LINE1 RT an der umgekehrten Transkription und Integration von SARS-CoV-2-Sequenzen in die Genome infizierter Zellen beteiligt sein kann.

Etwa 30% der viralen Integranten, die in kultivierten Zellen analysiert wurden, fehlte eine erkennbare LINE1-Endonuklease-Erkennungsstelle in der Nähe. Somit ist es auch möglich, dass die Integration durch einen anderen Mechanismus erfolgen kann. Tatsächlich gibt es Hinweise darauf, dass chimäre cDNAs in Zellen produziert werden können, die durch Copy Choice mit endogenen IAP-Elementen während der umgekehrten Transkription akut mit LCMV infiziert sind. Es wird erwartet, dass dieser Mechanismus eine chimäre cDNA schafft, die sowohl LCMV als auch IAP ergänzt. In einigen Fällen wurden die resultierenden chimären cDNAs ohne die Generierung einer Zielort-Duplizierung integriert (29). Eine kürzlich durchgeführte Studie hat auch gezeigt, dass die Wechselwirkung zwischen Coronavirus-Sequenzen und endogenem Retrotransposon ein potenzieller viraler Integrationsmechanismus sein könnte (40).

In Folgestudien wird es wichtig sein, das Vorhandensein von SARS-CoV-2-Sequenzen zu demonstrieren, die in das Wirtsgenom in Patientengewebe integriert sind. Dies wird jedoch technisch schwierig sein, da nur ein kleiner Bruchteil der Zellen in Patientengeweben für Virussequenzen positiv sein soll (61). Im Einklang mit diesem Begriff wurde geschätzt, dass nur 1 von 1.000 und 1 von 100.000 mit LCMV infizierten Mauszellen entweder in Kultur oder im Tier virale DNA-Kopien trugen, die in das Genom integriert waren (30). Darüber hinaus darf nur ein Bruchteil der Patienten SARS-CoV-2-Sequenzen tragen, die in die DNA einiger Zellen integriert sind. Da jedoch weltweit mehr als 140 Millionen Menschen mit SARS-CoV-2 infiziert sind (Stand April 2021), könnte selbst ein seltenes Ereignis von erheblicher klinischer Relevanz sein. Es ist auch schwierig, die Häufigkeit von Retro-Integrationsereignissen in Zellkultur-Assays abzuschätzen, da infizierte Zellen normalerweise sterben und vor der Probenentnahme verloren gehen. Aus dem gleichen Grund wird in akuten Infektionsexperimenten keine klonale Expansion integrierter Zellen erwartet. Darüber hinaus kann die Wahrscheinlichkeit einer Integration am selben genomischen Ort bei verschiedenen Patienten/Geweben aufgrund eines zufälligen Integrationsprozesses gering sein.

Das Vorhandensein von chimären Virus-Wirt-RNAs in Zellen kann nicht allein als starker Beweis für die Transkription integrierter Virussequenzen angesehen werden, da eine Vorlagenumschaltung während des umgekehrten Transkriptionsschritts der cDNA-Bibliotheksvorbereitung erfolgen kann. Wir fanden jedoch heraus, dass nur ein sehr kleiner Bruchteil (0–1%) der chimären Messwerte aus akut infizierten Zellen virale RNA-Sequenzen mit negativem Strang enthielt, während in den von einigen Patienten erstellten RNA-Seq-Bibliotheken der Anteil der gesamten viralen Messwerte und der Anteil der human-viralen chimären Messwerte, die von SARS-CoV-2-RNAs mit negativem Strang abgeleitet wurden, wesentlich höher waren. Bei retrotransposonvermittelten Integrationsereignissen sollte die Orientierung der umgekehrt transkribierten SARS-CoV-2-RNA in Bezug auf die Ausrichtung eines Wirtsgens zufällig sein. Daher verknüpft bei chimären RNAs, die aus integrierten Virussequenzen abgeleitet werden, etwa die Hälfte der chimären Lesevorgänge positiver Wirts-RNA-Sequenzen mit Negativstrang-Virussequenzen. In einigen Patientenproben machten negative virale Lesevorgänge 40-50% der gesamten viralen RNA-Sequenzen aus, und ein ähnlicher Anteil der chimären Lesevorgänge enthielt negative virale RNA-Sequenzen, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit, wenn nicht alle viralen RNAs in diesen Proben aus integrierten Virussequenzen abgeleitet wurden.

Es ist wichtig zu beachten, dass, da wir nur subgenomische Sequenzen nachgewiesen haben, die hauptsächlich vom 3′-Ende des in die DNA der Wirtszelle integrierten viralen Genoms abgeleitet sind, infektiöse Viren nicht aus solchen integrierten subgenomischen SARS-CoV-2-Sequenzen hergestellt werden können. Die Möglichkeit, dass SARS-CoV-2-Sequenzen in das menschliche Genom integriert und in Form von chimären RNAs exprimiert werden können, wirft mehrere Fragen für zukünftige Studien auf. Drücken integrierte SARS-CoV-2-Sequenzen virale Antigene bei Patienten aus und könnten diese den klinischen Verlauf der Krankheit beeinflussen? Die verfügbaren klinischen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass höchstens ein kleiner Bruchteil der Zellen in Patientengewebe Virusproteine auf einem Niveau exprimiert, das durch die Immunhistochemie nachweisbar ist. Wenn jedoch eine Zelle mit einer integrierten und exprimierten SARS-CoV-2-Sequenz überlebt und nach der Infektion ein virales oder neoantigen aufweist, könnte dies zu einer kontinuierlichen Stimulation der Immunität führen, ohne ein infektiöses Virus zu produzieren, und könnte eine schützende Reaktion oder Bedingungen wie Autoimmunität auslösen, wie sie bei einigen Patienten beobachtet wurde (62 Das Vorhandensein von LCMV-Sequenzen, die in die Genome akut infizierter Zellen bei Mäusen integriert sind, veranlasste die Autoren, zu spekulieren, dass die Expression solcher Sequenzen "potenziell eine natürlich produzierte Form des DNA-Impfstoffs darstellt" (30). Es ist nicht bekannt, wie viele Antigen-präsentierende Zellen benötigt werden, um eine Antigenreaktion auszulösen, aber die deprimierte LINE1-Expression, die durch eine Virusinfektion oder durch Exposition gegenüber Zytokinen (38-40) induziert wird, kann die SARS-CoV-2-Integration in das Genom infizierter Zellen bei Patienten stimulieren. Generell deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Integration von viraler DNA in somatische Zellen eine Folge einer natürlichen Infektion darstellen kann, die eine Rolle bei den Auswirkungen anderer häufiger krankheitsverursachender RNA-Viren wie Dengue, Zika oder Influenzavirus spielen könnte.

Unsere Ergebnisse können auch für aktuelle klinische Studien mit antiviralen Therapien relevant sein (64). Wenn Integration und Expression von viraler RNA ziemlich häufig sind, spiegelt die Abhängigkeit von extrem empfindlichen PCR-Tests zur Bestimmung der Wirkung von Behandlungen auf die Virusreplikation und Viruslast möglicherweise nicht immer die Fähigkeit der Behandlung wider, die Virusreplikation vollständig zu unterdrücken, da die PCR-Tests virale Transkripte nachweisen können, die aus viralen DNA-Sequenzen stammen,

Materialien und Methoden

Zellkultur und Plasmidtransfektion.

HEK293T-Zellen wurden aus ATCC (CRL-3216) gewonnen und in DMEM kultiviert, ergänzt durch 10% wärmeinaktiviertes FBS (HyClone; SH30396.03) und 2 mM L-Glutamin (MP Biomedicals; IC10180683) nach der ATCC-Methode. Calu3-Zellen wurden aus ATCC (HTB-55) gewonnen und in EMEM (ATCC; 30-2003) kultiviert, ergänzt durch 10% wärmeinaktiviertes FBS (HyClone; SH30396.03) nach der ATCC-Methode.

Plasmide für die menschliche LINE1-Expression, pBS-L1PA1-CH-mneo (CMV-LINE-1), war ein Geschenk von Astrid Roy-Engel, Tulane University Health Sciences Center, New Orleans, LA (Addgene plasmid #51288 ; http://addgene.org/51288; R Die Transfektion wurde mit Lipofectamine 3000 (Invitrogen; L3000001) gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt.

SARS-CoV-2-Infektion.

SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 (GenBank: MN985325.1) wurde aus BEI-Ressourcen gewonnen und auf Vero-Zellen erweitert und zerstreut. Zellen wurden 48 Stunden lang in DMEM plus 2% FBS mit einer Infektionshäufigkeit (MOI) von 0,5 für die Infektion von HEK293T-Zellen und einem MOI von 1 oder 2 für Calu3-Zellen infiziert. Die gesamte Probenverarbeitung und Ernte mit infektiösem Virus erfolgte in der BSL3-Einrichtung des Ragon Institute.

Nukleinsäureextraktion und PCR-Test.

Die zelluläre DNA-Extraktion wurde mit einer veröffentlichten Methode durchgeführt (31). Zur Reinigung der genomischen DNA wurde die gesamte zelluläre DNA 1,5 Stunden lang auf einem 0,4%igen (wt/vol) Agarose/1× TAE-Gel mit einer Spannung von 3 V/cm, mit λ DNA-HindIII Digest (NEB; N3012S) als Größenmarkierungen fraktioniert. Große Fragmente (> 23,13 kb) wurden ausgeschnitten, in -80 °C eingefroren und dann mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Drei Volumina (vol/wt) mit hohem T-E-Puffer (10 mM Tris-10 mM EDTA, pH 8,0) wurden hinzugefügt, und dann NaCl hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 200 mM zu erhalten. Die Gellösung wurde 15 Minuten lang mit konstanter Mischung bei 70 °C erhitzt und dann mit Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1, Vol/vol/vol) (Life Technologies; 15593031) und Chloroform: Isoamylalkohol 24:1 (Sigma; C0549-1PT) extrahiert. DNA wurde durch die Zugabe von Natriumacetat und Isopropylalkohol ausgefällt. Für Proben mit niedriger DNA-Konzentration wurde Glykogen (Life Technologies; 10814010) als Träger hinzugefügt, um die Ausfällung zu unterstützen.

Die RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen; 74034) gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt.

Um DNA-Kopien von SARS-CoV-2-Sequenzen nachzuweisen, haben wir vier NC-Gen-Targeting-PCR-Primer-Sets ausgewählt, die in COVID-19-Tests verwendet werden [SI-Anhang, Abb. S1A, Primer-Quelle der Weltgesundheitsorganisation (67), modifiziert, um der Genomversion von NC_045512.2 zu entsprechen]. Siehe SI-Anhang, Tabelle S4 für PCR-Primersequenzen, die in dieser Studie verwendet werden. Die PCR wurde mit AccuPrime Taq DNA Polymerase, High Fidelity (Life Technologies; 12346094) durchgeführt. PCR-Produkte wurden mit 1% oder 2% (wt/vol) Agarosegel betrieben, um Verstärkungen zu zeigen.

Nanoporen-DNA-Sequenzierung und -Analyse.

Insgesamt 1,6 μg DNA, die aus HEK293T-Zellen extrahiert wurde, die mit dem pBS-L1PA1-CH-mneo (CMV-LINE-1) Plasmid transfiziert und mit SARS-CoV-2 infiziert wurden, wurde verwendet, um eine Sequenzierungsbibliothek mit dem SQK-LSK109-Kit (Oxford Nanopore Technologies) zu erstellen und 3 d und 5 Minuten lang auf einer R9 PromethION-Flowcell (FLO-PRO002) sequenziert wurde. Die Sequenzierungsdaten wurden mit Guppy 4.0.11 (Oxford Nanopore Technologies) unter Verwendung des hochpräzisen Modells genannt.

Nanoporenlesungen wurden mit Minimap2 (68) (Version 2.15) mit den Parametern "-p 0.3 -ax map-ont" und einer Fasta-Datei mit der menschlichen Genomsequenz aus der ENSEMBL-Freisetzung 93 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/homo_s Aus der SAM-Datei haben wir alle Sequenzen ausgewählt, die dem viralen Genom zugeordnet wurden, und sie basierend auf den menschlichen Chromosomen, denen sie zugeordnet waren, in Gruppen unterteilt. Wir haben die ausgewählten Sequenzen mit Blastn gegen eine BLAST-Datenbank gesprengt, die mit den oben beschriebenen menschlichen und Virussequenzen erstellt wurde. Wir haben die Blast-Ausgabe in eine Textdatei mit einer Zeile pro High-Scoring-Segment-Paar (HSP) mit einem benutzerdefinierten Perl-Skript analysiert. Wir haben diese Datei für jede Sequenz weiter gefiltert, indem wir alle viralen HSPs und die drei wichtigsten menschlichen HSPs ausgewählt haben. Wir haben diese Dateien visuell inspiziert, um Sequenzen zu identifizieren, die human-viral-human- oder human-virale Verbindungen enthalten. Für ein paar Sequenzen, länger als 30 kb, haben wir die Top 15 menschlichen HSPs inspiziert. Darüber hinaus haben wir alle identifizierten Lesevorgänge, die menschliche und virale Sequenzen enthalten, durch das BLAT (69) Tool der University of California, Santa Cruz (UCSC) visuell untersucht. Aufgrund von Fehlern in der Nanoporensequenzierung und/oder Base-Calling existieren in einer Teilmenge dieser Lesevorgänge Artefaktsequenzen, manchmal mit Watson- und Crick-Strängen aus demselben DNA-Fragment, das im selben Lesevorgang vorhanden ist. Daher konzentrierten wir uns nur auf chimäre Sequenzen, die klare Mensch-Virus-Verbindungen zeigen, und analysierten bekannte LINE1-vermittelte Retropositionsmerkmale wie Duplikate an der Zielseite und LINE1-Endonuklease-Erkennungssequenzen als Nachweis einer Integration.

Tn5 Tagmentation-vermittelte Integration Site Enrichment.

Wir haben eine tagmentationsbasierte Methode verwendet, um virale Integrationsstellen anzureichern (47, 48). Kurz gesagt, wir haben die Tn5-Transposase (Diagenode; C01070010) verwendet, um die zelluläre DNA zufällig mit Adaptern (Adapter A, das Illumina Nextera-System) zu markieren. Die Tagmentierung wurde mit 100 ng DNA für 10 Minuten bei 55 °C durchgeführt, gefolgt von der Abisolierung der Tn5-Transposase aus der DNA mit SDS. Wir verwendeten einen Reverse Primer, der auf das Near-5′-Ende des SARS-CoV-2 NC-Gens (CCA AGA CGC AGT ATT ATT GGG TAA A) abzielt, oder einen Forward Primer, der auf das Near-3′-Ende des SARS-CoV-2-Genoms abzielt (CTT GTG CAG AAT GAA TTC TCG TAA CT), um die markierten DNA-Fragmentierten DNA-Fragmente, die Virussequenzen enthalten, linear zu verstärken (PCR0, 45 Zyklen). Wir nahmen das Produkt PCR0 und verstärkten die DNA-Fragmente, die Adapter- und Virussequenzen (potenzielle Integrationsstellen) enthielten, mit 15-20 Zyklen PCR1, mit einem Barcode (i5) Nextera-Primer (AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACN NNN NNN NTC Der virale Primer wurde entwickelt, um entweder auf das nahe-5′ Ende des SARS-CoV-2 NC-Gens (GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGCC GAC GTT GTT TTG ATC G, Virussequenz unterstrichen) oder auf das nahe-3′ Ende des SRAS-CoV-2-Genoms abzielt (GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GCGC GGA GTA CGA TCG AGT G, Virussequenz unterstrichen). Der virale Primer enthielt auch eine Adaptersequenz zur weiteren PCR-Amplifikation. Wir verstärkten das PCR1-Produkt um 15–20 Zyklen PCR2, wobei wir einen kurzen Primer (AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA) gegen die i5 Nextera-Primersequenz und einen Barcode (i7) Nextera-Primer (CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN Das Endprodukt der PCR2-Amplifikation wurde auf 1,5% Agarosegel (Sage Science; HTC1510) mit PippinHT (Sage Science; HTP0001) fraktioniert und 500- bis 1.000-bp-Stücke wurden für die Illumina-Paar-End-Sequenzierung ausgewählt. Alle drei PCR-Schritte (PCR0-PCR2) wurden mit KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA;KK2602) durchgeführt.

Illumina-DNA-Sequenzierung und -Analyse.

Wir haben Bibliotheken für die HEK293T-Zell-Ganzgenomsequenzierung mit dem Tn5-basierten Illumina DNA Prep Kit (Illumina; 20018704) erstellt. Die Ganzgenom-Sequenzierungsbibliotheken oder die Bibliotheken von der Tn5-vermittelten Integrationsstandortanreicherung nach der Dimensionierung (siehe oben) wurden einer Illumina-Sequenzierung unterzogen. qPCR wurde verwendet, um die Konzentrationen jeder Bibliothek mit dem KAPA qPCR-Bibliotheksquant-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll Bibliotheken wurden dann bei äquimolaren Konzentrationen für jede Spur gepoolt, basierend auf qPCR-Konzentrationen. Die gepoolten Bibliotheken wurden mit dem Illumina-Protokoll denaturiert. Die denaturierten Bibliotheken wurden auf eine SP-Flowcell auf einem Illumina NovaSeq 6000 geladen und laufen gemäß den Anweisungen des Herstellers 2 × 150 Zyklen. Fastq-Dateien wurden mit der bcl2fastq Conversion Software (Illumina) generiert und demultiplexed.

Um chimäre DNA-Lesevorgänge von Human-SARS-CoV-2 zu identifizieren, wurden rohe Sequenzierungslesungen mit STAR (70) (Version 2.7.1a) auf ein menschliches plus SARS-CoV-2-Genom ausgerichtet, das mit einer Fasta-Datei erstellt wurde, die die menschliche Genomsequenzversion hg38 enthält, ohne dass alternative Chromosomen mit Die folgenden STAR-Parameter wurden verwendet, um chimäre Lesevorgänge aufzurufen: –alignIntronMax 1 \–chimOutType Junctions SeparateSAMold WithinBAM HardClip \–chimScoreJunctionNonGTAG 0 \–alignSJstitchMismatchNmax -1–1 -1–1 \–chimSegment Wir haben virale Lesevorgänge aus der generierten BAM-Datei von samtools (71) (Version 1.11) mit dem Befehl extrahiert: samtools view -b Aligned.sortedByCoord.out.bam NC_045512v2 > NC_Aligned.sortedByCoord.out.bam. Wir extrahierten human-virale chimäre Lesevorgänge, indem wir die Lesenamen aus der von STAR generierten Datei Chimeric.out.junction verwendet haben, um die Leseausrichtungen aus der STAR-generierten Chimeric.out.sam-Datei von Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) zu erhalten, wobei wir den Befehl java -jar picard.jar FilterSamReads I = Chimeric.out.sam O = hv-Chimeric.out.sam READ_LIST_FILE = hv-Chimeric.out.junction.ids FILTER = includeReadList verwenden. Wir bestätigten weiter jede der chimären Lesungen und filterten alle nicht überzeugenden Lesevorgänge (zu kurz oder auf mehrere Stellen des menschlichen Genoms ausgerichtet) durch visuelle Inspektion mit dem UCSC BLAT (69) Tool heraus. Wir haben auch die von STAR generierte Datei Aligned.sortedByCoord.out.bam oder die Datei NC_Aligned.sortedByCoord.out.bam mit extrahierten viralen Lesevorgängen in das UCSC-Browser SARS-CoV-2-Genom (NC_045512.2) geladen, um nach zusätzlichen chimären Lesevorgängen zu suchen, die von der STAR-Chimären Aufrufmethode übersehen wurden. Um eine Genomabdeckungsdatei zu generieren, haben wir die bamCoverage aus der deepTools-Suite (72) (Version 3.5.0) verwendet, um die von STAR generierte Datei Aligned.sortedByCoord.out.bam in eine Bigwig-Datei zu konvertieren, die bei 10 bp gespeichert ist, indem wir den Befehl: bamCoverage -b Aligned.sortedByCoord.out.bam -o Aligned.sortedByCoord.out.bw–binSize 10 verwenden.

RNA-Seq und Analyse.

Um chimäre Lesevorgänge von Human-SARS-CoV-2 zu identifizieren, wurden veröffentlichte RNA-Seq-Daten vom Gene Expression Omnibus (GEO) mit den Beitrittsnummern GSE147507 (50), GSE153277 (51), GSE156754 (52), GSE157852 (53), GSE153684 (54 S5C). Rohsequenzlesungen wurden mit STAR (70) (Version 2.7.1a) auf den Menschen plus SARS-CoV-2-Genom und Transkriptom ausgerichtet, die mit einer Fasta-Datei erstellt wurden, die die menschliche Genomsequenzversion hg38 enthält, ohne dass alternative Chromosomen mit der SARS-CoV-2-Sequenz aus der NCBI-Referenzsequenz NC_045512.2 verkettet sind, und einer gtf-Datei, die die menschlichen Genanmerkungen aus der ENSEMBL-Version GRCh38.97 enthält, die mit den SARS-CoV-2-Genannotationen von NCBI verkettet sind (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/wuhCor1/bigZips/genes/). Die folgenden STAR-Parameter (56) wurden verwendet, um chimäre Lesevorgänge aufzurufen, sofern nicht anders angegeben (SI-Anhang, Abb. S5C):–chimOutType Junctions SeparateSAMold WithinBAM HardClip \–chimScoreJunctionNonGTAG 0 \–alignSJstitchMismatchNmax -1–1 -1–1 \–chimSegmentMin 50 \–chimJunctionOverhangMin 50.

Für die RNA-Seq-Strängeness-Analyse generierten wir RNA-Seq-Daten mit RNA aus SARS-CoV-2-infizierten Calu3-Zellen. Gestrandete Bibliotheken wurden mit dem Kapa mRNA HyperPrep Kit (Roche; 08098115702) erstellt. Bibliotheken wurden mit einem KAPA qPCR-Bibliotheksquant-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll qPCR'ed. Bibliotheken wurden dann bei äquimolaren Konzentrationen für jede Spur gepoolt, basierend auf qPCR-Konzentrationen. Die gepoolten Bibliotheken wurden mit dem Illumina-Protokoll denaturiert. Die denaturierten Bibliotheken wurden auf einen HiSeq 2500 (Illumina) geladen und 120 Zyklen von einem Ende der Fragmente sequenziert. Basecalls wurden mit Illumina Offline Basecaller (OLB) durchgeführt und dann demultiplexiert. Wir haben veröffentlichte RNA-Seq-Daten (gestrandete Bibliotheken) von GEO mit den Beitrittsnummern GSE147507 (50) (Calu3, SI-Anhang, Tabelle S1), GSE148697 (58) (Lungenorganoide, SI-Anhang, Tabelle S1) und GSE150316 (60) (Patienten Rohe RNA-Seq-Lesevorgänge wurden wie oben beschrieben ausgerichtet, wobei parameters-chimSegmentMin 30 \–chimJunctionOverhangMin 30 verwendet wurden, um chimäre Lesevorgänge aufzurufen. Wir extrahierten die gesamten viralen Lesevorgänge und die von Mensch-Virus-Chimäre-Lesevorgänge wie oben beschrieben. Wir konvertieren die viral gelesenen BAM-Dateien mit dem Dienstprogramm bamToBed in BEDTools (73) in Bed-Dateien. Wir haben dann die Gesamtzahl und die gestrandeten Lesenummern in den konvertierten BED-Dateien gezählt.

Veröffentlichte einzellige RNA-Seq-Daten wurden von GEO mit der Beitrittsnummer GSE145926 (61) (PatientenbalF-Proben, SI-Anhang, Tabelle S3) heruntergeladen. Für die Massenanalyse wurden doppelte Lesevorgänge mit den gleichen read1- (UMI) und read2-Sequenzen in rohen Fastq-Dateien von dedup_hash (https://github.com/mvdbeek/dedup_hash) entfernt. Dann wurde der Pool von read2 wie oben beschrieben ausgerichtet, wobei die Parameter -chimSegmentMin 30 \–chimJunctionOverhangMin 30 verwendet wurden, um chimäre Lesevorgänge aufzurufen. Die Lesestrandedness wurde wie oben beschrieben analysiert. Für die Einzelzellanalyse haben wir ein benutzerdefiniertes Genom von Cell Ranger (10× Genomics Cell Ranger 3.0.2) (74) mkref erstellt, wobei eine Fasta-Datei verwendet wurde, die die menschliche Genomsequenz aus der ENSEMBL-Freisetzung 93 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta Die Lesezuordnung, das Zuweisen von Lesevorgängen zu Zell-Barcodes und das Entfernen von PCR-Duplikaten wurden mit Cell Ranger (10× Genomics Cell Ranger 4.0.0) (74) unter Verwendung des oben beschriebenen benutzerdefinierten Genoms durchgeführt. Wir haben die Zählungen mit Seurat (Version 3.2.2) (75) verarbeitet. Wir entfernten Zellen, die weniger als 200 Gene oder mehr als 20% der Transkriptzahlen aus den Mitochondrien entdeckt hatten. Für jede Zelle haben wir die Anzahl der Lesevorgänge gezählt, die entweder dem positiven oder negativen Virusstrang zugeordnet sind.

Unterstützende Informationen

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